PCR技术基本原理

一、PCR技术的简史

1971年

Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。

但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……

1985年

美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）。基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制，采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错，耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪。

1993年

Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖。

二、PCR的基本原理

类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。

End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。